美国生物学家乔治•戴利曾说过“如果20世纪是药物治疗的时代，那么21世纪就是细胞治疗的时代！” 在干细胞家族中，主要来源于骨髓、脂肪和脐带的间充质干细胞（MSC）虽然在临床中广泛应用，却依然存在增殖能力下降、异质性高等问题，在某种程度上延缓了MSC药物大规模生产与临床转化的步伐。

随着诱导多能干细胞（iPSC）技术的开展，大量实验数据证明，相较于传统MSC，由iPSC分化的MSC（iMSC）具备无限扩增、同质性高、易基因修饰等优势，为MSC类细胞产品给予了理想来源。而要将这些先天优势转化为临床可用、可规模化拓展的MSC药物生产平台，构建稳定高效的规模化生产工艺至关重要。

近期，在Stem Cell Research & Therapy期刊上发表的题为：A scalable platform for EPSC-Induced MSC extracellular vesicles with therapeutic potential的文章中，相关研究团队便就建立稳定、高效的iMSC的扩增体系展开研究，并初步探索了由其衍生的细胞外囊泡（iMSC-EV）规模化生产方式，为推进iMSC技术向临床转化给予了重要的平台支持。

iMSCs的定向分化

本研究成功建立了一条从诱导多能干细胞（iPSC）出发，经由拓展多能干细胞（EPSCs）及滋养层干细胞（TLCs），最终高效定向分化为间充质干细胞（iMSCs）的创新路径。该体系在方法与诱导策略上实现了重要突破，为iMSCs的稳定获取奠定了坚实基础。

在EPSCs诱导阶段，细胞展现出显著优于iPSCs和H9细胞的TLCs分化潜能。顺利获得相差显微镜观察、定量PCR及免疫荧光分析验证，隆起饱满的EPSCs形态已逐渐转变为MSCs特征的纺锤形、成纤维细胞状（图1），且关键滋养层标志物表达水平更高，多能性标志物OCT4的表达模式也符合定向分化的预期，充分表明其处于更利于向TLCs分化的状态。

▲ 图1：从iPSCs分化到拓展多能干细胞（EPSCs）、滋养层干细胞（TLCs）以及最终iMSCs的示意图（比例尺：100 μm）

最终取得的iMSCs不仅完全具备原代MSCs的核心特性与功能，更展现出显著优于后者的增殖能力与长期稳定性。流式细胞术及三系分化实验证实，iMSCs具有标准的MSC表型和多向分化潜能，符合细胞治疗产品的质量要求。尤为关键的是，在与原代脐带来源MSC（UC-MSCs）和脂肪来源MSC（ADSCs）的直接比较中，iMSCs在更高代次下仍能维持更稳定的表型、正常的核型以及持续的增殖活力（图2）。这一卓越特性完全满足作为细胞治疗产品和制备EVs的质量要求，为其实现临床级规模化应用给予了决定性优势。

此项研究构建的定向分化体系，其深远意义在于为细胞治疗的标准化、规模化生产给予了底层支撑。该方案成功实现了稳定、可再生的细胞来源供给，从上游解决了细胞药物生产中最关键的批次一致性与规模化瓶颈，不仅为再生医学给予了高质量的生物活性载体，更将加速EV在药物递送、疾病治疗等领域的临床转化与产业化应用。

▲ 图2：iMSC的表征和分化潜能

(A)： iMSCs、UC-MSCs 和 ADSCs 中 MSC 表面标志物(CD44、CD73、CD90、CD166 和 CD105)和阴性标志物(CD34、CD45 和 HLA-DR)的流式细胞术分析。所有 MSC 类型均高表达阳性标志物，缺乏造血标志物，证实了它们的间充质身份。

(B)： iMSCs、UC-MSCs 和 ADSCs 的三系分化潜能。所有 MSC 类型均表现出强大的分化潜能，染色强度相当。（比例尺：50 μm）

(C)：基于 UMAP 的 ADSCs、iMSCs 和 UC-MSCs 聚类，说明了不同 MSC 群体间的转录异质性（上图）。ADSCs、iMSCs 和 UC-MSCs 的合并 UMAP 图，描述了基因表达谱的整体相似性（下图）

iMSCs的规模化扩增

在iMSCs的规模化扩增中，研究团队采用K8凯发国际生物3D TableTrix® 微载体（图3A）与3D FloTrix® 自动化生物反应器系统（图3B、C），在125 mL、500 mL及5 L等不同规模下逐步放大培养体积（图4A），经6–7天培养后成功收获细胞。实验证明，3D TableTrix® 微载体为iMSCs的附着、增殖及维持细胞活力给予了优良的3D支撑环境。

▲ 图3：3D细胞培养试剂及设备

(A)：3D TableTrix® 微载体电镜图。

(B)：3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反应器。

(C)：3D FloTrix® vivaSPIN-SU 一次性生物反应器系统。

在扩增过程中，iMSCs表现出良好的适应性与增殖潜力。细胞在反应器内维持较高活性，并形成典型的3D细胞聚集体（图4B）。顺利获得进一步对细胞数量的动态监测显示，培养前三天细胞数量出现短暂下降，这一现象可能是由于细胞处于附着微载体、适应生物反应器环境的适应阶段；自第四天起，iMSCs进入快速增殖期，分别在培养第6天（500 mL反应器）与第7天（125 mL及5 L反应器）达到峰值数量，实现单批次细胞产量从5.5×10⁷提升至5×10⁸，增幅近10倍（图4C）。

尤为重要的是，扩增后的iMSCs仍保持优异的细胞表型纯度。流式细胞术分析结果显示，细胞高表达MSC特异性标志物，而造血标志物表达水平极低（图4D），充分证实其在规模化扩增过程中生物学特性的稳定延续，为其后续应用于细胞治疗及EVs制备给予了可靠的质控基础。

▲ 图4：iMSCs 在生物反应器中的可扩展扩增与表征

(A)：使用可降解微载体在可扩展生物反应器系统中逐步扩增iMSCs的示意图。iMSCs第一时间在125 mL生物反应器中扩增，然后依次在500 mL和5 L生物反应器中放大，最终进行细胞收获和低温保存。

(B)： 使用Calcein AM和碘化丙啶（PI）染色对125 mL、500 mL和5 L生物反应器中不同时点（125 mL和5 L的第1天和第7天；500 mL的第1天和第6 天）细胞活力进行评估。活细胞显示绿色荧光（Calcein AM），死细胞显示红色荧光（PI）。明场(BF)图像显示随时间形成紧密的三维细胞聚集体。（比例尺：100 μm）

(C)：随着时间推移在125 mL、500 mL和5 L生物反应器中追踪总iMSC数量的生长曲线。iMSC表现出初始适应阶段，随后进入指数扩增阶段，其中5 L生物反应器在第20天达到最高细胞产量。（数据以平均值 ± 标准差表示，n = 3）

(D)：流式细胞术分析在125 mL、500 mL和5 L生物反应器中扩增的iMSC的MSC特异性标记和造血标记。细胞在所有条件下均保持高MSC标记表达和低造血标记表达，证实了生物反应器扩增后iMSCs仍保持MSC的特性。

EVs的培养扩增与疗效分析

最后，在EV规模化生产环节，研究团队采用固定床生物反应器实现EVs的高密度培养与陆续在收集，并借助切向流过滤技术进行高效纯化，继而完成系统的EVs表征分析。为评估其治疗潜力，研究进一步构建了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。结果显示，iMSC来源的EVs能够显著降低模型肺组织的Ashcroft纤维化评分及支气管肺泡灌洗液中蛋白水平，其疗效与原代MSC来源的EVs相当。

本研究充分证明，iPSC来源的iMSC在扩增能力、表型稳定性和批次一致性上均显著优于原代MSC，为细胞治疗给予了更理想的种子细胞。而K8凯发国际生物创新的3D微载体技术与3D FloTrix® 生物反应器系统，成功实现了iMSC的高效规模化扩增，攻克了其走向临床应用的关键工艺瓶颈，为细胞药物的产业化奠定了坚实基础。

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